La basilica di San Sebastiano si trova tra il III e il IV miglio dell'antica via Appia e originariamente denominata "Basilica Apostolorum".

Fu costruita per volere dell'Imperatore Costantino nel IV sec. d.c. in onore degli apostoli Pietro e Paolo. Infatti, secondo la tradizione, durante le persecuzioni di Valeriano del III sec. d.c., le reliquie degli Apostoli furono qui traslate e venerate per circa cinquant'anni. La venerazione a San Sebastiano nel corso dei secoli ha prevalso nella denominazione del cimitero e della basilica, oggi a lui dedicata "vox populi".

Nel 1608 il cardinale Scipione Borghese intraprese un completo rimodellamento della basilica e della cripta di San Sebastiano, su progetto di Flaminio Ponzio e sotto la direzione artistica di Guido Reni. Il restauro fu completato dal Vasanzio mentre la facciata è datata 1612 ed è del Ponzio. La basilica fu restaurata occupando la sola navata centrale dell'antica circiforme costantiniana, ormai in decadenza. La chiesa vanta un notevole soffitto ligneo intagliato (eseguito da Annibale Durante sul disegno tradizionalmente attribuito a Giovanni Vasanzio nel 1612).

All'ingresso, sulla parete sinistra, si trova affisso il carme, pressoché integro, dedicato da papa Damaso al martire Eutichio, che rappresenta uno dei più importanti esempi della famosa calligrafia filocaliana. 

A seguire si trova l'altare con l'urna contenente i resti di San Sebastiano e la sua statua, scolpita da Giuseppe Giorgetti, rappresenta il Santo disteso, trafitto dalle frecce del martirio. 

Da ingressi posti ai lati della chiesa moderna si accede alla navata esterna. Oggi si conserva solo parte del deambulatorio, costituito dagli ambienti a destra e a sinistra dell'attuale basilica. Il primo che da accesso alle catacombe ospita una ricca collezione di sarcofagi del luogo, detto "Museo dei Sarcofagi".

L'ambiente di sinistra è occupato dalla "Cappella del Crocifisso" e dal museo epigrafico, in restauro e chiuso al pubblico.

Di seguito all'altare maggiore si trova la cappella Albani, fatta erigere da papa Clemente XI per la sua famiglia nel 1706. È rivestita in preziosi marmi policromi con decorazioni dedicate al papa martire San Fabiano (236-250). Sempre sul lato destro della navata si trova la "Cappella delle reliquie", fatta decorare da Massimiliano duca di Baviera nel 1625: conserva una freccia del martirio di San Sebastiano e la colonna cui fu legato.

Al centro della suddetta cappella è conservata la pietra dell'episodio del "Quo Vadis?", che reca impresse le impronte dei piedi del Cristo.